1.4. ОСОБЕННОСТИ ЦИТОПАТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ ТОКСИНОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСОБО ОПАСНЫХ ИНФЕКЦИЙ

1.4.1. Особенности цитопатогенного действия токсинов возбудителей холеры

Холера представляет собой острое диарейное заболевание, инду-цируемое токсигенными штаммами Vibrio cholerae серогруппы 01, вклю-чающей классический биовар Эльтора, а также серогруппы 0139.

Характерной особенностью холерных вибрионов является их способ-ность заселять тонкий кишечник с последующим развитием острого воспали-тельного процесса и диареи. Селективность повреждения тонкого кишечника обусловлена продукцией возбудителями холеры адгезивных молекул, вклю-чающих токсинкорегулируемые пили (toxin coregulated pilus) или TCP, ман-нозофукорезистентные и маннозочувствительные гемагглютинины-адгезины, а также белки внешней мембраны с выраженными адгезивными свойствами.

Как стало очевидно в последние годы, TCP - это белок, состоящий из повторяющихся субъединиц с ММ 20,5 кД, продуцируемый серогруппами возбудителей холеры 01 и 0139. Обнаружены определенные различия амино-кислотных последовательностей TCP различных серогрупп и биоваров Vibrio cholerae (Смирнова Н.И., 1999). Вслед за адгезией к энтероцитам и колониза-цией тонкого кишечника Vibrio cholerae возникают интенсивная продукция и секреция холерного токсина – СТ (Cholera toxin).

Описание структуры и биологических свойств холерного токсина при-ведено в ряде монографий и обзорных работ (Покровский В.И., Малеев В.В., Адамов А.К., 1988; Иванов К.К., 1991; Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г., 1995; Смирнова Н.И., 1999; Клер К.И., Карен С.М., Алисон Д., 2000).

В настоящее время известно, что СТ - белок с ММ 84 кД, состоящий из 1 субъединицы А и 5 субъединиц В. Субъединица А с ММ 27,2 кД состоит из 2 пептидов – А1 и А2, отвечающих за токсическую активность всей молеку-лы.

Комплекс В-субъединиц (ММ 58 кД) обеспечивает связывание токсина с клеточным рецептором - ганглиозидом Gm1 энтероцитов, несет антигенные детерминанты, вызывает развитие мукозальных иммунных реакций и синтез IgA.

В последние годы описаны два семейства токсинов (ST), являющихся причиной диареи при кишечных инфекциях (STа и STв). STа-токсины про-дуцируются самыми разнообразными бактериями, вызывающими заболева-ния желудочно-кишечного тракта: энтеротоксигенными E. coli, Vibrio cholerae, Vibrio mimicus, Yersinia enterocolitica, Citobacter freundii, Klebsiella spp.

STа транслируются в виде молекулы-прекурсора, которая после дву-кратного расщепления в процессе созревания выделяется во внеш-нюю сре-ду. Зрелые ST - небольшие пептиды, содержащие от 19 до 53 аминокислот-ных остатков. Токсины, относящиеся к семейству STа, имеют на С-конце по-следовательность из 13 аминокислотных остатков, определяющую токсич-ность и термостабильность токсина. 6 остатков цистеина, объединенных 3 дисульфидными мостиками в составе данного домена, обусловливают ток-сичность этой молекулы.

Связывание STа со специфическим клеточным рецептором приво-дит к активации мембраноассоциированной гуанилатциклазы, которая в свою очередь превращает внутриклеточный ГМФ в циклический ГМФ. Возраста-ние в энтероцитах уровня ц-ГМФ сопровождается подавлением адсорбции ионов натрия и увеличением секреции ионов хлора. Изменение ионных по-токов приводит к развитию секреторной диареи (Клер К.И., Карен С.М., Алисон Д., 2000).

Вышеизложенное делает очевидным, что "специфичность" патогенного действия холерного токсина весьма относительна и характерна для токсинов ряда энтеропатогенных возбудителей диарейных заболеваний.

Как известно, особенностями холерной инфекции являются взаимопо-тенцирующие эффекты холерного токсина и эндотоксина (ЛПС), а также ферментных факторов патогенности, продуцируемых возбудителями холеры.

Ферменты холерного вибриона представляют собой термолабильные белки. Наиболее значимыми в дезорганизации биологических мембран и межклеточного матрикса в динамике холерной инфекции являются протеаза, коллагеназа, эластаза, фибринолизин, муциназа, амилаза (Адамов А.К., На-умшина М.С., 1984).

Касаясь молекулярно-клеточных механизмов патогенного действия ос-новных токсических факторов возбудителей холеры, следует отметить ряд общепринятых концепций и современные взгляды относительно цитокино-посредованных биологических эффектов холерных токсинов. Установлено, что цитопатогенные эффекты холерного токсина связаны прежде всего с его способностью фиксироваться на клеточных рецепторах энтероцитов, вклю-чающих ганглиозид Gm1.

Однако рецепция холерного токсина может осуществляться и другими клеточными элементами, в частности, клетками печени, щитовидной железы, жировыми клетками, эритроцитами, тромбоцитами.

В течение 30 минут после контакта экзотоксина с рецептором происхо-дят образование комплекса токсин-ганглиозид, гидролиз токсина на субъе-диницы А и В, формирование в мембране клеток канала при участии В-пептидных цепей и рецептора, транслокация токсической субъединицы А по указанному каналу на внутреннюю поверхность мембраны клеток с после-дующей диссоциацией ее на пептидные цепи (Покровский В.В., Малеев В.В., Адамов А.К., 1988; Смирнова Н.И., 1999).

Пептид а субъединицы А холерного токсина представляет собой фер-мент АДФ-рибозилтрансферазу, который катализирует отщепление АДФ-рибозы от НАД и перенос ее на белки, регулирующие функции других фер-ментов, в частности ГТФ-азу. После АДФ-рибозилирования ГТФ-аза утрачи-вает специфическую активность, образует комплекс с ГТФ, обеспечивающий активацию аденилатциклазы и резкое увеличение цАМФ в энтероцитах (Адамов А.К., 1981).

Значение цАМФ в развитии мукозального адъювантного ответа под влиянием холерного токсина отмечено и в более поздней работе (Cheng E., Cardenas-Freytag L., Clements J.D., 1999).

Таким образом, сопоставляя приведенные выше данные, следует отме-тить две точки зрения на механизмы развития холерной диареи: либо через увеличение активности мембраноассоциированной гуанилатциклазы и уров-ня цГМФ в энтероцитах, либо за счет активации аденилатциклазной системы и возрастания в клетках цАМФ. Не исключена возможность взаимодействия двух указанных механизмов, индуцируемых холерным токсином.

Как указывалось выше, в динамике заболевания холерой биологиче-ские эффекты холерного токсина потенцируются при участии ЛПС. Деталь-ная характеристика молекулярно-клеточных механизмов действия ЛПС представлена выше. Установлено, что токсичность О – антигена холерного вибриона коррелирует с содержанием глюкозамина (Громова О.В., Захарова Т.Л., Грачева В.П., 1990).

В последнее время появились данные о том, что биологические эффек-ты ЛПС и холерного токсина опосредуются за счет внутриклеточного обра-зования стереотипных мессенджеров. Причем, большинство экспериментов было выполнено в указанном направлении с использованием возбудителя холеры серогруппы 01. Однако в последне время показана цитокинопосредо-ванная патогенность и для возбудителей холеры серогруппы 0139 (Gorowara S., Sapru S., Ganguli N.K., 1998). Так при изучении влияния ЛПС и холерного токсина на активность макрофагов установлено, что каждый из токсинов ин-дуцировал выделение ИЛ-1-бета. В то же время выявлены и особенности их действия. ЛПС индуцировал выделение ИЛ-12, а холерный токсин – экспрес-сию CD80-86 (Foss D.L., Lilliox M.J., Murtaugh M.P., 1999). В другой работе ус-тановлена дозозависимая стимуляция синтеза ИЛ-12 и TNF-альфа макрофа-гами под влиянием холерного ЛПС. Использование миметика ц-АМФ блоки-ровало синтез обоих цитокинов макрофагами, подвергаемыми микробной стимуляции. В то же время установлено, что холерный токсин индуцирует образование мукозальными эпителиальными клетками цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-6, Ил-8, а также вызывает образование макрофагами ИЛ-1 и ИЛ-12 (Foss D.L., Murtaugh M.P., 1999).

Между тем, ИЛ-12 оказывает адъювантное действие на антигенные свойства холерного токсина, усиливает его эффекты на образование интер-ферона-гамма и ИЛ-10 в легких и селезенке.

Показано, что инкубация альвеолярных макрофагов с холерным токси-ном ингибировала как базальную, так и ЛПС-стимулированную активность фосфолипазы А2. В последнее время описан ИЛ-17, полученный из Т-клеток. Оказалось, что холерный токсин, подобно Pg E2 и миметикам цАМФ, подав-ляет ИЛ-17-индуцированное освобождение TNF-альфа.

В работах последних лет установлено, что при участии А-компонента холерного токсина обеспечивается дозозависимое ингиби-рование продукции ИЛ-12 макрофагами на уровне генной транскрипции. В то же время очищен-ный В-компонент токсина оказывает менее выраженное аналогичное дейст-вие. Холерный токсин ингибирует выделение TNF моноцитами, но не влияет на выделение ИЛ-10, ИЛ-6, Pg E2.

Проявлениями биологического действия холерного токсина являются дыхательный "взрыв" макрофагов и усиление активности NO-синтазы. До-бавление холерного токсина к клеточным ячейкам одновременно с ЛПС усиливает выделение TNF-альфа. При инактивации холерного токсина нагре-ванием или моноклональными антителами этот эффект исчезал.

Резюмируя в целом приведенные выше данные, следует заключить, что "специфические" патогенные эффекты возбудителей холеры обусловливают-ся лишь на начальных этапах развития инфекционного процесса за счет спо-собности Vibrio cholerae продуцировать определенный комплекс молекул адгезии и колонизировать тонкий кишечник с последующей рецепцией хо-лерного токсина Gm1 рецепторами энтероцитов. Дальнейшее развитие вос-палительно-деструктивного процесса в тонком кишечнике обеспечивается комплексом биологически активных веществ и цитокинов, при посредстве которых формируются системные метаболические сдвиги, расстройства мик-роциркуляции в различных органах и тканях, развитие синдрома полиорган-ной недостаточности.

Обращает на себя внимание тот факт, что в динамике развития холеры, наряду с доминирующим в клинике диарейным синдромом, возникают рез-кие нарушения коагуляционного потенциала, реологических свойств и кле-точного состава периферической крови.

Как показали результаты экспериментов, проведенных на различных моделях холерной интоксикации, общими закономерностями рас-стройств гемостаза при холерном эндотоксикозе у высокочувствительных и относи-тельно резистентных животных являются развитие прогрессирующей недос-таточности внутреннего и внешнего механизмов формирования активности протромбиназного, активация антикоагулянтных механизмов и системы фибринолиза, истощение запасов фибриногена на ранних стадиях холерной интоксикации, индуцируемой введением ЛПС или сочетанным воздействием токсинов возбудителей холеры.

Развитие холерного эндотоксикоза у высокочувствительных животных сопровождается формированием более глубоких и пролонгированных сдви-гов коагуляционного потенциала крови, чем у относительно резистентных животных, вплоть до полного истощения внутреннего и внешнего механиз-мов формирования активного протромбиназного комплекса, развития афиб-риногенемии.

Холерный энтеротоксин при комплексном воздействии его с холерным ЛПС на высокочувствительных животных оказывает выраженный модули-рующий и потенцирующий эффекты на сдвиги коагуляционного потенциала крови, свойственные ЛПС- интоксикации. На фоне комбинированного введе-ния токсинов высокочувствительным животным возникает более выражен-ный дефицит плазменных факторов свертывания крови, обеспечивающих каскадную активацию протромбиназы, а также истощение активаторов плаз-миногена и запасов фибриногена.

На различных моделях холерной интоксикации показано, что в роли индуктора системных расстройств микроциркуляции, гемореологии, коагу-ляционного потенциала крови выступает эндотоксин. Системные патогенные эффекты эндотоксина усиливаются воздействием эндотоксина обеспечивая в то же время сенсибилизацию кишечника к повреждающему воздействию хо-лерогена за счет дегрануляции тучных клеток и освобождения вазогенных провоспалительных цитокинов. (Понукалина Е.В. и соавт., 1987; Понукалина Е.В. и соавт., 1989; Ponukalina E.V. et al., 1991; Понукалина Е.В., Киричук В.Ф., 1995; Ponukalina E.V et al., 1995; Понукалина Е.В., 1996; Ponukalina E.V., et al., 1997; Ponukalina E.V., Bogomolova N.V., 1998; Ponukalina E.V., et al., 2000; Ponukalina E.V., et al.V.F.Kirichuk, N.P.Chesnokova, S.O.Bersudsky, 2000; Понукалина Е.В., Чеснокова Н.П., Киричук В.Ф.,2001).

В динамике холерной интоксикации, индуцируемой введением ЛПС или сочетанным воздействием токсинов на высокочувствительных и относи-тельно резистентных животных, выявлена однотипная закономерность сни-жения вязкости цельной крови, обусловленная рядом патогенетических фак-торов: дефицитом фибриногена и снижением вязкости свойств плазмы, раз-витием эритропении, нарушением структуры липидного бислоя эритроци-тарных мембран, появлением "жестких" эритроцитов с низкой осмотической резистентностью. (Понукалина Е.В., Киричук В.Ф., 1998; Понукалина Е.В. и соавт., 1999; Понукалина Е.В. и соавт. 1999; Понукалина Е.В., 2001).

Нарушения реологических свойств крови при холерной ЛПС- интокси-кации у высокочувствительных животных в достаточной мере обратимы. Оп-тимальный эффект коррекции вязкостных свойств крови и состояния эритро-цитарных мембран достигнут при комплексном использовании глюкокорти-коидов, антиоксидантов, мембранопротекторов, ингибиторов протеаз, (Пону-калина Е.В. и соавт., 1998; Понукалина Е.В., Киричук В.Ф., 1999).

Ведущая роль в патогенезе расстройств коагулогемостаза и реологиче-ских свойств крови при холере в соответствии с результатом проведенных нами экспериментов должна быть отведена активации свободнорадикального окисления и соответственно системной дезинтеграции биологических мем-бран.

Как оказалось, холерная ЛПС-интоксикация характеризуется акти-вацией процессов липопероксидации, сочетающейся у относительно рези-стентных животных с дозозависимой недостаточностью ферментного звена антиоксидантной системы, а у высокочувствительных - к действию ЛПС жи-вотных - с прогрессирующей активацией ферментов антиоксидантной систе-мы. Холерный токсин оказывает модулирующее воздействие ЛПС на актив-ность СОД и каталазы при сочетанном воздействии токсинов на относитель-но резистентных и высокочувствительных животных, не влияя существенно на уровень продуктов липопероксидации в крови. (Ponukalina E.V. et al., 1995; Понукалина Е.В. и соавт., 1997; Понукалина Е.В. 1997; Ponukalina E.V., et al.,1997; Ponukalina E.V., et al., 1998; Ponukalina E.V., Kirichuk V.F. , 1998; Ponukalina E.V., et al. , 1998 ).

Достигнута положительная динамика патоморфологических сдвигов микроциркуляции, а также гемореологии и активации процессов липоперок-сидации в динамике холерной интоксикации, индуцируемой комплексным введением ЛПС и экзотоксина или ЛПС под воздействием мембранопротек-торов, антиоксидантов, препаратов антипротеазного действия, адреномоду-ляторов. Последнее указывает, с одной стороны, на патогенетическую зна-чимость активации процессов липопероксидации в механизмах потенцирова-ния цитопатогенных эффектов холерных токсинов, а с другой стороны – от-крывает перспективы в использовании новых принципов медикаментозной коррекции метаболических и гемореологических сдвигов при холерной ин-фекции и интоксикации. (Понукалина Е.В., Афанасьева Г.А., 1997; Понука-лина Е.В. и соавт., 1998 ).

Единый принцип структурной организации эндотоксинов грам-отрицательных бактерий, ведущая роль ЛПС в механизмах системных пато-генных эффектов возбудителей холеры позволяют экстраполировать лишь с определенной долей вероятности обнаруженные нами закономерности рас-стройств гемостаза, фибринолиза, микроциркуляции, гемореологии, актива-ции процессов липопероксидации, а также возможности их медикаментозной коррекции на системную эндотоксемию другой бактериальной природы. Не-обходимо учитывать тот факт, что при различных грамотрицательных ин-фекциях возникает модификация цитопатогенных эффектов эндотоксина под влиянием других ферментных и токсических факторов патогенности, что придает определенную "специфику" структурным, метаболическим и функ-циональным сдвигам, свойственные тому или иному инфекционному заболе-ванию.

ЛИТЕРАТУРА

112. Адамов А.К. Иммунология холеры. - Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1981. - 320 с.

113. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы.- Саратов: Изд-во Саратовского ун-та, 1984. - 328 с.

114. Громова О.В., Захарова Т.Л., Грачева В.П. //Микробиол., биохим. и специфич. профилактика карантийных инфекций. - Саратов, 1990. - С. 122-126.

115. Иванов К.К. //Успехи совр. Биологии.- 1991- Т. III, вып.5.- С.667-682.

116. Киричук В.Ф., Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В. и соавт. //Доклады IV Всесоюзного съезда патофизиологов.- Кишинев, 1989.

117. Киричук В.Ф., Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Белов Л.Г.//Физиологические механизмы развития экстремальных состояний: Материалы конф.- СПб., 1995. – С. 35-36.

118. Киричук В.Ф., Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В., Белов Л.Г.//Материалы I Всерос. конф. «Гомеостаз и инфекционный про-цесс».- Саратов, 1996.- С.219.

119. Клер К.И., Карен С.М., Алисон Д. //Клиническая микробиология и антимикробная химио-терапия. -2000. - Т.2, N1.- С. 4-16.

120. Мохин К.М.,Чеснокова Н.П., Понукалина Е.В. //Тез. Докл. конф. ге-матологов РСФСР «Принципы организации гематологической помо-щи».- 1987 - С. 213-214.

121. Наумов А.В., Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г. Иммунология холеры. – Саратов, 1995. - 69 с.

122. Покровский В.И., Малеев В.В., Адамов А.К. Клиника, патогенез и ле-чение холеры. – Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1988. - 272 с.

123. Понукалина Е.В. //Биоантиоксидант: Материалы международного симпозиума «Медицина и охрана здоровья». – Тюмень, 1997. – С.28.

124. Понукалина Е.В., Киричук В.Ф. //Материалы Всерос. науч. конф. С международным участием « К 150-летию со дня рождения акад. И.П. Павлова».- СПб., 1999 – С.11-12.

125. Понукалина Е.В., Чеснокова Н.П., Киричук В.Ф. //Тромбоз, гемостаз, реология.- 2001.- № 7.

126. Понукалина Е.В., Чеснокова Н.П., Киричук В.Ф., Адамов А.К. //Материалы науч.-практ. конф., посв. 100-летию образования противо-чумной службы России.- Саратов, 1997. – Т.2.- С.101-102.

127. Чеснокова Н.П., Афанасьева Г.А., Жевак Т.Н., Понукалина Е.В. //Биоантиоксидант: Материалы V Междунар. конф., 1998.

128. Смирнова Н.И. //Мед. генетика, микробиол. и вирусол. -1999. - N4. - С. 3- 10.

129. Cheng E., Cardenas-Freytag L., Clements J.D. //Vaccine. - 1999. - Vol.18, N1-2. - P. 38-49.

130. Foss D.L., Lilliox M.J., Murtaugh M.P. //Infect. Immun. - 1999. - Vol.67, N10. - P. 5275-5281.

131. Foss D.L., Murtaugh M.P. //Adv. Vet. Med. - 1999. - N41. - P. 83-104.

132. Gorovara S., Sapru S., Ganguli N.K. //Biochim.,Biophys.Acta.- 1998.- Vol.1407, №1.- P.21-30.

133. Kirichuk V.F., Chesnokova N.P., Ponukalina E.V. et al. //Proc. Interna-tional I Society for Pathophysiology., 1991. – P. 231.

134. Kirichuk V.F., Chesnokova N.P., Ponukalina E.V. //Journal of Thrombosis and Haemostasis.- Florence, Italy.- 1997.- P.545.

135. Kirichuk V.F., Chesnokova N.P., Ponukalina E.V. et al. //16 th Interna-tional Congress On Thrombosis.- Portugal.- 2000.- Ref. 222.

136. Kirichuk V.F., Ponukalina E.V. //16 th International Congress On Throm-bosis.- Portugal.- 2000.- Ref. 223.

137. Ponukalina E.V., Bogomolova N.V. //Haemostasis International Journal on Haemostasis and Thrombosis Research. – Antalia, Turkey.- 1998.- P. 493.

138. Ponukalina E.V., Chesnokova N.P., Kirichuk V.F. et al. //Journal of Thrombosis and Haemostasis.- Florence, Italy.- 1997.- P.544.

139. Ponukalina E.V., Kirichuk V.F. //The Official Journal of the International Society for Pathophysiology.- Finland, 1998.- Vol. 5.- P.20.

140. Ponukalina E.V., Kirichuk V.F., Chesnokova N.P., Sinkeeva M.V. //Journal of the International Society on Thrombosis and Haemostasis.- 1995.- Vol. 73, № 6.

предыдущий раздел | содержание| следующий раздел